水环境中硝基苯与钒酸盐电刺激同步去除方法、接种物与流程

本说明书一个或多个实施例涉及环境治理技术领域，具体涉及一种水环境中硝基苯与钒酸盐电刺激同步去除方法、接种物。

背景技术：

经济的高速发展，人类的需求越来越多，废气废水的排放日益增多，未经处理的废水被人为向环境中肆意排放，使得环境中含有大量有机物和重金属，对人类健康和生态系统稳态构成了威胁。

硝基芳香族化合物(nacs)是难降解的异源生物的重要组成部分，已广泛用于染料，颜料，药物，农药，橡胶化学品，工程塑料，炸药和其他领域。而硝基苯(nb)作为nacs的一种，被广泛生产作为有机合成的炸药，农药，溶剂和中间体。

众所周知，nacs应用于生产生活各个方面中，nacs的不正当使用使得其进入地表水、地下水与土壤之中，由于其毒性和潜在的环境影响，作为nacs的一种，nb环境污染污染问题很严重，nb具有苦杏仁味道，同时nb可以通过皮肤和呼吸进入人体，损害人体器官，据相关报道，nb会影响男性生殖系统-睾丸的发育，以至于在睾丸中产生组织学改变，细胞减少，并改变精子运动和形态。与此同时，人体吸收或吸入超过一定量的nb，可以导致溶血、肝肾功能的损伤，甚至还会引发身体重要器官的癌变。被排放到环境之中的nb容量越来越多，健康风险不容小视。

钒(v)是自然环境中普遍存在的五大过渡金属元素之一，在地壳中的含量等于锌(zn)，大约是铜(cu)的两倍，是铅(pb)的十倍之多，v广泛分布在火成岩和沉积岩石和矿物质中在矿物质、原油以及煤炭中。环境中的v来源主要来自三个方面：天然岩石的风化、煤、石油等燃料的燃烧以及含v矿物的开采与冶炼等，在现代工业中，v主要应用于钢材以改善强度和耐腐蚀性，而且还在许多其他行业中使用，包括颜料，催化剂和药品。由于v优异的性能，使得人类对v的需求越来越大，人们开始密集的采矿和冶炼活动，因此越来越多的v由此进入环境之中，造成环境污染。冶炼活动高温挥发释放大量有毒金属，包括v，zn，cu，通过大气沉降过程进入土壤，造成土壤污染。在冶炼钒矿过程中会产生大量废气和废水，废水直接进入地下水中，造成地下水污染。另外，废气通过雨水冲刷和淋溶进入地下水中，引起污染。

v作为一种人体和动植物所必须的微量元素之一，对人体健康和动植物的生长发育都至关重要，人体适量的摄取v元素，能促进人体造血功能，调整心血管和肾脏功能，降低血糖等功能，v和钼(mo)的作用相似，能提高植物固氮的效果、提高植物的光合作用的效率，在提高产量、改善品质方面，v起到不可替代的作用。过量的v浓度会影响到植物的生长，当土壤v含量较高时，大豆叶片会变黄、枯萎，地上部和根系产量显著下降。过量的v被人体摄入时，会导致甲状腺活动紊乱、肾功能衰竭；当每日摄入v的量超过3ppm时，会引起腹泻、绿舌和血液学改变，威胁人体健康。

值得注意的是，由于经济的快速发展使得人类活动越来越多，致使环境中对nb和v(v)的共存成为一个复杂严重的问题。对nb和v(v)复合污染通常共存于矿山开发、染料合成、冶炼加工场地，农田附近。与此同时，由于nb的毒性较强，使用传统的原位生物修复技术无法非常有效地去除nb，因此，迫切需要高效地方法来处理环境中对nb和v(v)复合污染。

技术实现要素：

本说明书实施例描述了一种水环境中硝基苯与钒酸盐电刺激同步去除方法、接种物，可以在高效且稳定地从水中同时去除硝基苯与五价钒。

第一方面，本说明书实施例提供了一种水环境中硝基苯与钒酸盐电刺激同步去除方法，所述方法包括：将接种物接种到生物反应器中，所述接种物为攀枝花钒污染场地的沉积物；对所述接种物进行驯化；将至少含有硝基苯、五价钒和碳源的第一合成地下水注入到含有驯化后的所述接种物的生物反应器中，并在0.3v-1.2v电压刺激下，进行硝基苯和五价钒的同步去除反应；其中，所述同步去除反应至少进行48小时；在所述同步去除反应期间，保持所述生物反应器内为厌氧环境。

在一个实施例中，所述在0.3v-1.2v电压刺激下，进行硝基苯和五价钒的同步去除反应具体为：在0.6v电压刺激下，进行硝基苯和五价钒的同步去除反应。

在一个实施例中，在所述第一合成地下水中，五价钒的初始浓度为10mg/l，硝基苯的初始浓度为10mg/l。

在一个实施例中，接种物的接种体积和生物反应器的容积的比值为1：5。

在一个实施例中，所述碳源为乙醇，且在所述第一合成地下水中的初始浓度为100mg/lcod。

在一个实施例中，所述对所述接种物进行驯化包括：向含有所述接种物的生物反应器中，注入第二合成地下水，以进行驯化反应；所述第二合成地下水含有五价钒、硝基苯和碳源。

在一个实施例中，在所述第二合成地下水中，五价钒的初始浓度为10mg/l，硝基苯的初始浓度为10mg/l，碳源初始浓度为100mg/lcod。

在一个实施例中，所述驯化反应持续20个周期，每个周期的时长为48小时；其中，每个周期更换一次所述生物反应器中的所述第二合成地下水。

第二方面，本说明实施例提供了一种用于水环境中硝基苯与钒酸盐电刺激同步去除的接种物的驯化方法，包括：将接种物接种到生物反应器中，所述接种物为攀枝花钒污染场地的沉积物；接种物的接种体积和生物反应器的容积的比值为1：5；向含有所述接种物的生物反应器中，注入第二合成地下水，以进行驯化反应；所述第二合成地下水含有初始浓度为10mg/l的五价钒、初始浓度为10mg/l的硝基苯、初始浓度为100mg/lcod的乙醇；所述驯化反应持续20个周期，每个周期的时长为48小时；其中，每个周期更换一次所述生物反应器中的所述第二合成地下水。

第三方面，本说明实施例提供了一种由第二方面所述的方法驯化得到的接种物。

本说明书实施例提供的方案可以稳定且高效地同时去除水环境中的硝基苯和五价钒。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1示出了不同电压刺激下生物降级硝基苯和五价钒的研究结果；其中，图1中的a示出了四种不同电压下反应器20周期内nb浓度变化；图1中的b示出了四种不同电压下反应器20周期内v(v)浓度变化；图1中的c示出了四种不同电压下单一周期内nb浓度变化；图1中的d示出了四种不同电压下单一周期内nb浓度变化的伪一级动力学；图1中的e示出了四种不同电压下单一周期内v(v)浓度变化；图1中的f示出了四种不同电压下单一周期内v(v)浓度变化的伪一级动力学。

图2示出了nb与v(v)同步去除特征的研究结果；其中，图2中的a示出了实验组反应器20周期内nb和v(v)浓度变化；图2中的b示出了实验组反应器20周期内v(v)浓度变化；图2中的c示出了单一周期内nb去除效率；图2中的d示出了单一周期内nb的伪一级动力学模型；图2中的e示出了单一周期内v(v)去除效率；图2中的f示出了单一周期内v(v)的伪一级动力学模型；图2中的g示出了单一周期内ph变化图；图2中的h示出了单一周期内orp变化图。

图3示出鉴定nb和v(v)还原的产物；其中，图3中的(a)示出了toc浓度；图3中的(b)示出了an浓度和(c)nh4+-n生成量；图3中的(d)示出了碳毡生物膜结构的扫描电镜；图3中的(e)示出了eds结果；图3中的(f)示出了溶解总钒的去除效率的时间曲线；图3中的(g)示出碳毡表层生物膜的xps分析结果。

图4示出了不同影响因素对e-nb-v在一个典型循环(48h)中的nb和v(v)还原的影响；其中，图4中的a示出了初始nb浓度对e-nb-v在一个典型循环(48h)中的nb还原的影响；图4中的b示出了初始nb浓度对e-nb-v在一个典型循环(48h)中的v(v)还原的影响；图4中的c示出了初始v(v)浓度对e-nb-v在一个典型循环(48h)中的nb还原的影响；图4中的d示出了初始v(v)浓度对e-nb-v在一个典型循环(48h)中的v(v)还原的影响；图4中的e示出了初始乙醇剂量对e-nb-v在一个典型循环(48h)中的nb还原的影响；图4中的f示出了初始乙醇剂量对e-nb-v在一个典型循环(48h)中的v(v)还原的影响。

图5示出了不同影响因素下nb和v(v)去除效果的动力学拟合；其中，图5中的a示出了初始nb浓度对nb去除的影响；图5中的b示出了初始nb浓度对v(v)去除的影响；图5中的c示出了初始v(v)浓度对nb去除的影响和；图5中的d示出了初始v(v)浓度对v(v)去除的影响；图5中的e示出了初始乙醇量对nb去除的影响；图5中的e示出了初始乙醇量对v(v)去除的影响。

图6示出了接种污泥与生物反应器中微生物群落的稀释性曲线；其中，图6中的a示出了阳极处的微生物群落的稀释性曲线；图6中的b示出了阴极处的微生物群落的稀释性曲线。

图7示出了接种物和所有生物反应器中的微生物结构和群落；其中，图7中的a示出了基于otu丰度数据的pca阳极图；图7中的b示出了基于out丰度数据的venn阳极图；图7中的c示出了基于otu丰度数据的pca阴极图；图7中的d示出了基于otu丰度数据的venn阴极图；图7中的e示出了阳极门微生物群落相对丰度；图7中的e示出了阳极属微生物群落相对丰度；图7中的g示出了阴极门微生物群落相对丰度；图7中的h示出了阴极属微生物群落相对丰度。

具体实施方式

应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

在矿山的开发、燃料的燃烧、农药和染料的合成等一系列生产生活过程中会产生大量的有机废气废水进入环境之中，使有机物污染成为危害很大的水体污染之一。nb，属于nacs的一种，广泛应用于生产an、染料、农药、炸药等，nb的广泛使用，使其不可避免地释放到环境中并导致土壤和地下水的严重污染，而在矿山开采过程中，伴随产生含有重金属的废气与废水，有机物与重金属经过电子废物的拆解过程协同进入土壤之中，随着雨水等作用进入水体，对土壤与地下水造成污染。

当有机物与重金属同时进入环境之中，一方面由于自身的毒性对环境构成污染威胁，另一方面还会因为污染物之间的加和作用或协同作用或对环境产生更大的毒害。

在中国攀枝花地区蕴藏着丰富的钒铁矿，随着生产生活需要的v资源开采越来越多，炸药的使用量增多，加上当地农业生产过程中各种农药的大量使用，使得炸药和农药中的nacs-nb成分进入土壤，通过雨水的冲刷与淋溶，进入地下水中，加上在开采过程中，v通过沉降和淋溶等方式在冶炼厂和农田附近富集，使得在地下水中nb与v(v)同时存在。

v的价态、溶解度影响着v对人体和动植物的毒性。在自然界中，v作为一种变价元素，存在几种形式，主要有v(ii)、v(iii)、v(iv)和v(v)，而在这几种钒的价态中，v(v)的毒性最大最稳定，且易迁移。而相对而言，v(iv)是一种相对无害的，大多数以固定形式存在，因此它很容易在环境中进行预培养(接近中性ph)，将v(v)还原成v(iv)，再通过中性沉淀的方式将v(v)从水中去除是一种高效经济的降低v(v)污染的方法。

地下水中含氮有机物的去除方法主要包括物理法、化学法以及生物法。具体介绍如下。

1.物理法

(1)吸附：吸附作用主要就是利用有关材料通过吸附作用将水中浓度较低的有机物吸附在材料上，从而将有机物从水中去除。吸附材料主要包括活性炭、砂隙，沸石和不同类型的粘土矿物等。

(2)微波辐射：微波辐射主要是通过微波能量，经过分子间相互作用和所施加的电磁场直接传递给材料，协同微波吸收剂将土壤与地下水中的有机污染物热解或挥发，降低土壤地下水的有机物的浓度。

(3)液液萃取：利用相似相容原理将废水中可回收利用的有机相萃取再利用，达到循环经济的效果。

2.化学法

(1)光催化氧化：光催化氧化技术主要利用光源中的紫外光，照射在可接受光激发的半导体上，产生导带电子并留下电子空穴，产生的电子空穴与吸附在半导体催化材料上的有机物发生氧化还原反应，有机物被分解产生二氧化碳和水，最终被去除。

(2)臭氧氧化：臭氧本身具有很强的氧化性，将臭氧通入有机污染的废水之中，利用其氧化性氧化有机物，最后降解有机物生成为小分子甚至矿化，达到去除有机污染物的效果。

(3)湿式氧化：主要是通过将压缩空气或高温高压为氧化剂，将有机物氧化成二氧化碳和水以及小分子有机物的过程，这个方法适用于治理高浓度且比较难降解的有机废水。

3.生物法：生物法降解有机物主要分为好氧降解和厌氧降解，通过创造适宜微生物生长的环境，使用好氧或厌氧的手段，微生物将废水中的有机物降解矿化。与此同时，在有机物被微生物降解过程中，人为的会添加利于微生物降解难降解有机物的碳源，诸如葡萄糖、乙酸钠、乙醇等，协同微生物降解有毒有机物成小分子物质，降低废水的有害性。

针对日益严重的地下水重金属污染的问题，世界各国的研究者针对如何修复地下水重金属这一问题进行长足的调查与研究，并取得了一定的进展。目前来说，异位修复和原位修复是修复地下水中重金属污染的主要技术。具体介绍如下。

1.异位修复

异位修复技术主要是利用抽提技术将受污染的地下水从原位抽出到地表，通过相关技术或手段将受污染的地下水修复至标准水平，或是将被重金属污染的地下水运至场外进行进一步处理。异位修复技术方便易于操作，修复效果立刻见效，但该技术也有其局限性，该项技术消耗能量大，所需要的的维护和运行成本高等。

2.原位修复

(1)可渗透反应格栅技术

近些年来，可渗透反应格栅技术，简称prb，作为原位地下水污染技术的一种，发展迅速。prb系统是一个在地下环境中装有填有活性材料格栅体，当地下水中的污染进行扩散时，污染羽通过活性材料格栅体时，污染羽中的污染组分被活性材料先吸附、沉淀后被降解去除，地下水因此得到净化处理。在prb中，活性材料在prb中去除地下水污染物发挥主要作用，在修复过程之中，活性材料主要使用沸石、活性炭、零价铁和微生物。prb具有良好的修复能力、长久的稳定性和经济便捷等优点。

(2)原位化学修复技术

原位化学修复技术是一种利用化学药剂的氧化还原性质，将具有氧化或还原性质的化学药剂注入或掺入受污染的地下水环境中，化学药剂发挥作用将污染物质破坏、降解成低价态、无毒物质的技术。该技术常用于修复被cr(vi)、v(v)污染的地下水。原位化学修复技术具有去除重金属效率高，投入成本相对较低，修复周期较短等优势，但是当地下水环境中重金属种类较多时，原位化学修复过程中化学药剂可能会产生二次污染，同时还会触发新的重金属污染的按钮。

(3)原位电修复技术

原位电修复技术主要是利用电渗析、电迁移以及电泳等电动效应形成电场梯度，污染物质在形成的电场中被分散、转化，然后转化成带电离子，然后被迫迁移消除，最终达到修复重金属的效果。原位电修复技术不但可以应用于重金属修复，还可以应用于地下水中有机物的去除，例如，通过电修复技术，降低土壤中的三氯乙烯的污染浓度从而减小对地下水的威胁。

(4)原位生物修复技术

原位生物修复技术是一种不改变地下水原有环境，通过加入营养物质，如有机碳源或其他微量元素，或者通入空气进入受污染的地下水，通过地下水环境中固有的微生物或人工选择出的功能菌种的作用将地下水中的污染组分，包括有机物和重金属，去除降解，净化地下水的技术。如微生物可以在外加碳源甲醇的作用下，还原地下水中v(v)和菲(phe)，原位生物修复技术具有处理效果立竿见影，不产生二次污染、节俭运行成本等优点，而且该技术能与其他技术相互结合，备受关注。

综上来看，对于修复地下水有机物和重金属复合污染技术进行评估，物理法简单有效，去除体量大，但是工艺复杂，设备维护成本大。化学法，处理过程可能会产生新的二次污染。生物法具有环境友好和成本效益的双重优点，是处理地下水中有机物与重金属双重污染的优选方法。结合地下水中复杂的有机物和重金属污染情况，以及运行成本和二次污染的问题，处理含氮有机物协同v重金属污染的地下水，原位修复技术为最佳选择。

原位修复技术有如下两种技术。

1生物修复应用

针对于地下水有机物与重金属污染，无论是从环境友好度还是治理成本上来讲，生物修复方法是处理地下水有机物与重金属双重污染的优选方法。正是因为有对环境友好且经济有效，因此越来越多的学者致力于使用生物法修复有机物与重金属复合污染方面的研究，其应用前景日益广泛。

针对于持久性难降解有机物与重金属复合污染环境下，单一方面依靠生物修复方法，无法快速有效对持久性有机物与重金属的解毒，而且由于复合污染的双重毒性会使得生物中毒而降低降解效果。而适量的电刺激结合生物修复，一方面能弥补单纯的依靠电修复副反应多、经济成本高等缺点，另一方面亦能弥补双重毒物对于微生物的损伤。尤其在复合污染环境下，电刺激生物修复技术应用广泛。

综上所述，生物修复与电刺激生物修复应用十分广泛，结合地下水中复杂的有机物和重金属污染情况，本说明书在厌氧条件下，利用混合微生物修复和电刺激微生物方式，处理含氮有机物协同v重金属污染的地下水，探究在含氮有机物与v(v)复合污染环境下，微生物去除复合污染物的响应机制。

本研究在于将分别使用混合微生物修复技术和电刺激生物修复技术对含氮有机物与v(v)去除的研究。首先验证同时去除二者的可行性，通过污染物中间产物的鉴定和中心实验影响因素的研究，最后结合16srrna测序技术探究微生物群落结构以及功能微生物，对可能存在的反应机理进行分析和评估。

由于nb是一种可以进行共代谢的难降解有毒有机物，实验将采用电刺激混合微生物方法，以乙醇作为电子供体，v(v)作为电子受体，通过适量的电刺激进行批实验研究。通过驯化，分析研究一周期内48h的情况下，探究nb和v(v)的去除情况，确定最佳电压，其次在最佳电压下设置中心实验组，进行长周期的驯化并研究一周期内nb和v(v)的去除，以及nb中间产物和v(v)还原产物的变化，之后针对在最佳电压下nb与v(v)复合污染下反应器的影响因素的研究，最后分析微生物群落变化，确定在电刺激下nb降解和v(v)还原发挥主要作用的功能微生物。

本说明实施例提供的方案，通过电刺激微生物条件，探究模拟nb和v(v)复合污染的地下水生物修复过程，研究最优电压和其他主要操作参数的变化对于反应器的变化，深入挖掘最优电压反应器的功能微生物菌属，为地下水中有机物与重金属复合污染下的电刺激微生物修复的实际应用提供理论支撑。

接下来，对本说明书实施例提供的方案进行具体说明。

实施例1，实验材料和化学试剂

实验材料

在电刺激下微生物降解硝基苯与钒酸盐实验中，准备4个大小为250ml的用锡纸包住血清瓶作为批实验生物反应器，每个血清瓶加入200ml合成地下水(如表1)和50ml的接种污泥，阴阳极选用1cm×1cm×0.5cm大小碳毡，用直径为1mm钛丝将碳毡固定，碳毡均在反应器地下水页面以下，双头老虎夹导线一头夹在阴阳两极，一头夹在恒定电源输出口，恒定电源调节到指定电压处运行反应器。所有反应器均在25±2℃中避光培养，实验用水皆为超纯水。接种污泥为采集自攀枝花钒污染场地的沉积物。

表1地下水成分

化学试剂

nb均购自美国sigma公司，纯度皆为99.5％。实验中以navo3(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)作为v(v)的来源，

在实验中，由于nb不溶于水，故使用乙醇作为实验碳源，设置四个实验组(表2所示)，即e-nb-v，e-nb、e-v和b-nb-v。e-nb-v代表含有在最佳电压下nb和v(v)的生物反应器，e-nb和e-v分别代表着最佳电压下分别只有nb和v(v)。b-nb-v代表没有电压只有nb和v(v)，nb和v(v)的初始浓度均为10mg/l。加入的乙醇量相当于100mg/l的化学需氧量(cod)。

表2制备的四组反应器

实施例2

电压优选可行性研究

使用不同电压即0.3v、0.6v、0.9v和1.2v，和含有初始浓度为10mg/lnb和初始10mg/l的v(v)以及初始浓度为100mg/lcod的乙醇的合成地下水对生物反应器驯化20个操作周期，每48h换水一次，用来评估最佳电压同步nb生物降解和v(v)生物还原过程。在驯化阶段监测nb和v(v)的去除效果。当所有反应器中nb和v(v)去除效果稳定时，以操作周期48h进行下一步实验。

当反应器驯化完成之后，在三个连续的反应周期内(每个操作周期48h)中评估nb和v(v)的去除性能。nb和v(v)的浓度水平与之前驯化阶段的水平保持一致。同时，其他的初始电压固定即0.3v、0.6v、0.9v和1.2v。将获得的数据进行伪一级动力学模型获得去除速率常数。

评估在四个不同电压下nb和v(v)的去除性能，选择最佳电压，然后在最优碳源体系下，运行四个实验组反应器，制备的反应器如表3所示。与之前条件一致，皆为20周期的驯化，每48h换水一次，当四组实验组反应器中nb和v(v)去除性能趋于稳定，开始进行下一步实验。在连续三个操作实验周期内(48h)中测试nb和v(v)的去除性能，并且将所获得的数据进行伪一级动力学模型获得反应器去除目标污染物速率常数。

理化性质测试

取样过程用注射器打入少量氮气利用气压差取样品检测，使用0.22μm过滤器对收集的水样进行预处理。

ph通过ph计(ph-201，hanna，意大利)检测。nb和an使用改良的还原偶氮法测试，其主要原理在酸性含有硫酸铜的溶液中，锌粉反应产生还原态氢，将nb还原为an，利用重氮偶合反应生成紫红色染料，比色测定，nb和an测试所需药品见表3。分光光度计(dr6000，hach，美国)用于监测nh4+-n。溶解的总钒的浓度通过电感耦合等离子体质谱法(icp-ms)(xseries,thermofisher,德国)来测定。使用总碳分析仪(toc-5000，日本岛津)测量总有机碳。沉淀物通过超声波从生物质和碳毡中分离，并通过以8000rpm离心收集。沉淀物的组成通过能量色散x光在扫描电子显微镜(jeoljax-840,hitachilimited,日本)上检测。用x光电子能谱(xps)(jeoljax-840,hitachilimited,日本)研究了产生的沉淀物的化合价。实验中所有仪器见表4。

表3化学药品

表4实验仪器

影响因素研究

采用单一变量原则在e-nb-v反应器中进行影响实验的研究。

首先研究初始nb的浓度的影响，初始nb的浓度梯度依次为5mg/l，10mg/l，15mg/l，20mg/l。

其次是研究初始v(v)的浓度的影响，初始v(v)的浓度梯度分别为5mg/l，10mg/l，15mg/l，20mg/l。

最后是研究初始乙醇的浓度的影响，初始乙醇的浓度的浓度梯度为50mg/lcod，100mg/lcod，150mg/lcod，200mg/lcod。在不同影响因素条件下检测、nb与v(v)浓度变化。

经过上述研究，发现初始nb的浓度为10mg/l，初始v(v)的浓度10mg/l，初始乙醇的浓度为100mg/lcod时，去除性能最佳。

微生物群落演化研究

对实验组e-nb-v，e-nb、e-v和b-nb-v阴阳极的微生物样品和收集进行超声预处理。根据制造商的说明使用spin试剂盒(qiagen,ca,美国)从收集的生物质样品中提取和纯化基因组dna。然后使用引物对515f和806r通过pcr(9700,abi,美国)扩增dna。之前的一项研究表明，在生物反应器中的生物量主要由细菌主导，因此在本实验中仅分析了细菌群落。pcr的扩增程序如下：首先在95℃下进行2分钟的变性，然后进行25个循环。每个循环持续90s，包括95℃下30s，55℃下30s和72℃下30s。最后，在72℃下延长5分钟。从2％的琼脂糖凝胶中提取获得的扩增子，然后分别使用axyprepdnagelextractionkit(axygenbiosciences,unioncity,ca,美国)和quantifluortm-st(promega,美国)进行纯化和定量。根据标准方法在等摩尔浓度的纯化扩增子汇集后，将其送至上海美吉生物科技公司(中国上海)在illuminamiseq平台(美国)进行高通量测序。测序完的数据使用flash和trimmomatic去除掉低质量的序列，并利用upares进行otu聚类，使之相似度达到97％，使用mothur计算α多样性。

实施例3，不同电压刺激下生物降解nb与v(v)还原的可行性研究

经过20周期的驯化实验之后，在四个施加不同电压的生物反应器之中，如图1中的a和图1中的b)所示，nb大部分去除，v(v)几乎全部去除。将含有初始浓度为10mg/l的nb和初始浓度为10mg/lv(v)以及初始浓度为100mg/lcod的乙醇加入到生物反应器中。之后同时连续运行所有反应器3个周期，周期结束时从每个反应器中抽取10ml溶液检测其中nb和v(v)的浓度。如图1中的c所示，施加0.6v电压的反应器，48h内nb去除率达到94.3±1.32％，高于施加0.3v(91.0±1.67％)、0.9v(89.6±1.15％)和1.2v(91.6±1.37％)时的去除率。适当的电刺激下能促进微生物降解nb。

v(v)的去除趋势与nb相似(图1中的e所示)，适当的电压刺激微生物增强了对v(v)的还原。在添加葡萄糖(87.2±0.856％)的生物反应器中观察到最高的v(v)去除效率，随后在电压0.3v、0.9v、1.2v下的生物反应器的v(v)的去除效率分别为85.7±0.327％、83.5±1.70％和85.5±0.294％。有研究表明，来自微生物燃料电池的电能可以提供电子以支持微生物对钒酸盐等污染物的解毒。与此同时，在连续的三个操作周期的实验过程之中，在四个不同电压刺激下的微生物反应器的nb和v(v)的去除可以用伪一级动力学来描述如图1中的d和图1中的f。拟一级动力学模型广泛用于描述生物反应器中物质的变化，使用式3-1伪一级动力学模型来描述nb和v(v)的降解。

ct＝c0·(1-e-kt)(3-1)

其中，ct是t时刻的污染物的浓度，c0是起始时刻的浓度，k是降解速率常数，t是反应时间。

如图1中的d和图1中的f，利用式3-1，得到四个不同电压下生物反应器的nb和v(v)的伪一级动力学方程，如表4-1所示，以电压为0.6v的反应器中nb的伪一级动力学速率常数为0.0534h-1，高于0.3v(0.0445h-1)，0.9v(0.0437h-1)和1.2v(0.0474h-1)，mec-0.6v生物反应器还原v(v)的伪一级动力学速率常数为0.0438h-1，亦高于mec-0.3v(0.0404h-1)，mec-0.9v(0.0375h-1)和mec-1.2v(0.0419h-1)。因此，我们选择0.6v作为构建生物电化学系统的最佳电压。

表4-1不同电压下各生物反应器中污染物的伪一级动力学方程及相关参数

实施例4，nb与v(v)同步去除特征

当生物电化学反应器确定最佳电压为0.6v之后，继续运行四个中心实验组生物反应器如图2中的a、图2中的b、图2中的c、图2中的d、图2中的e、图2中的f、图2中的g、图2中的h所示，即e-nb-v、e-nb、e-v和b-nb-v，经过40天(20周期)的驯化实验之后，所有中心实验组性能稳定。如图2中的a和图中的2b)所示，生物反应器e-nb-v、e-nb和b-nb-v的nb分别稳定在57.5±3.15％，72.5±5.13％和35.3±5.64％范围之内，e-nb-v、e-v和b-nb-v的v(v)的去除率分别稳定在85.4±4.32％，95.2±3.42％，57.2±1.10％。经过20次周期操作后，所有生物反应器在降解nb和v(v)还原方面均达到稳定性能。

在典型的48h操作中，nb在含nb的生物反应器中被逐渐去除(图2中的c所示)。在e-nb中nb去除率达到96.2±2.10％，平均去除率为0.200±0.004mg/l·h。拟一级动力学方程能较好地模拟nb去除动力学(图2中的d)，动力学速率常数为0.0649h-1(表4-2)。这一结果表明，在最优电压0.6v的电刺激下，能更好的激发微生物还原nb，更有研究指出，相比于其他碳源，乙醇的加入更好同步电刺激促进微生物还原nb。

在单一周期内，在适当电压(0.6v)的刺激下，实验组反应器ph呈下降的趋势，但整体ph基本稳定在7-8之间，与此同时，整体实验组的氧化还原电位(orp)升高，e-nb-v中orp从-100±1.35mv升高到-71.6±1.28mv，升高了28.4mv，在e-nb中orp从-97.9±0.75mv升高到-65.1±0.87mv，升高了32.8mv，在e-v中orp从-99.9±1.32mv升高到-72.9±0.86mv，升高27mv，在b-nb-v中orp从-102.2±1.3mv升高到-76.2±1.23mv，升高了26mv。整体反应器中ph处于中性环境，有利于反应器中v(v)还原产物v(iv)的去除，有报道指出，在较低的氧化环境下，有利于nb等nacs的厌氧还原，虽然整体实验反应器氧化还原电位有所上升，这说明在电刺激下，nb和v(v)发生一定的生物还原，这说明生物电化学系统的高效性能。

表4-2不同生物反应器中污染物的伪一级动力学方程及相关参数

实施例5，反应产物的鉴定

e-nb-v、e-nb、b-nb-v中的总有机碳浓度呈下降趋势(图3中的a所示)，表明部分nb矿化。在一个典型的运行周期内，e-nb-v、e-nb、b-nb-v中总有机碳去除率分别达到61.1±0.26％，65.7±0.75％，37.1±0.92％，可能是由于nb和乙醇的共同降解。先前的研究报告了nb生物电化学的还原途径，其中有机碳源的降解和一部分还原产物的降解，nb被还原生成an。研究指出，硝基芳烃有机物被降解成苯胺类有机物后，硝基芳烃有机物的毒性随之降低，说明在电刺激微生物体系下，能更好的降低nb的毒性。在一个操作周期48h之内，在本说明书实施例的研究中，nb还原产物an产量积累也在nb还原过程中观察到。在一个典型的循环中，最高浓度为3.36±0.15mg/l的an在e-nb中积累(图3中的b)。e-nb-v和e-nb反应器体系中产生的an量先增加后降低减少，说明nb还原生成的an进一步发生裂解矿化，可能会产生儿茶酚等其他有机物，而且在体系中检测出nh4+-n，最高浓度为1.14±0.064mg/l的nh4+-n在e-nb中积累(图3中的c)这说明体系中an部分降解且发生矿化。该结果基本上遵循了之前报道的nb还原途径，其中nb上的-no2还原成-nh2，生成an，然后降解为短链烯烃甲酸进入tca循环，同时产生少量nh4+-n。由于nb毒性较强，导致b-nb-v中的toc去除率和an生成量较低。

总钒的变化趋势与含钒生物反应器中v(v)的变化趋势相似(图3中的f)。实验过程中，e-nb-v、e-v、b-nb-v中总钒的去除率分别为71.7±3.49％、83.3±1.24％和50.5±2.61％。这一现象表明可溶性钒(v)已被还原为v(iv)，转为沉淀物从反应体系中去除。当反应结束之后，我们收集了阴极碳毡，通过扫描电镜图像显示微生物附着碳毡(图3中的d)。同时能谱(eds)分析表明碳毡上含有元素v(图3中的e)。我们将附有微生物膜的碳毡通过预处理之后，将收集到的样品进行xps分析，结果在v(iv)对应的v2p高分辨光谱中识别出515.9ev处的峰(图3中的g)，表明v(iv)是v(v)通过微生物转化的主要还原产物，且v(v)主要在微生物阴极被还原降解，突出生物电化学体系中电刺激的辅助作用。

实施例6，影响因素的研究

nb去除效率随初始nb浓度的增加而显着降低(图4中的a)。当最初的nb浓度为5mg/l时，nb在48h内的降解速率略高于其他nb浓度，且几乎完全还原降解(图4中的a)。当最初的nb浓度为20mg/l时，nb的生物降解效率从94.3±1.32％降至63.4±1.57％，去除速率从0.196±0.003mg/l·h降低至0.132±0.003mg/l·h。与此同时，初始nb浓度影响微生物对v(v)的还原降解(图4中的b)，当初始nb浓度从浓度10mg/l增加至20mg/l时，v(v)的去除效率从87.2±0.239％降低至63.9±0.789％，去除速率从0.182±0.0005mg/l·h降低至0.133±0.002mg/l·h。初始nb浓度的升高，nb的还原速率大大降低，结果表明，由于nb的毒性高于v(v)，使得当初始nb的浓度升高时，促使微生物优先还原v(v)。之前的报道指出当v(v)和cr(vi)当共存却被微生物还原降解，污染物的初始浓度对去除目标污染有相似的影响。

随着初始v(v)浓度的提高，nb同v(v)的降解速率下降(图4中的c)，可能是由于v(v)对nb降解物的毒性。先前的研究表明，随着反应体系中no3-浓度的增加，微生物降解对对氯硝基苯的速率会降低。初始v(v)浓度的增加加剧微生物同nb还原的竞争，致使nb还原速率下降。在较高的初始v(v)浓度下(图4中的d)，由于v(v)还原过程需要足够的碳源的支持，因此v(v)浓度的增加对v(v)减少也产生一定的负面影响。即使在高v(v)浓度的情况下，微生物也能很好地进行生物nb还原，体现了构建的系统对nb降解的高效性。

nb和v(v)的生物还原速率随着乙醇用量的增加而增加(图4中的e)。当初始乙醇用量从50mg/lcod增长至200mg/lcod时，nb的还原效率从84.3±2.35％增加到96.7±1.18％，而v(v)的还原效率也从84.6±0.43％增加到98.2±0.14％。在此操作条件下，v(v)要比nb被还原的快。nb和v(v)和的平均去除速率分别增加0.026±0.002mg/l·h和0.028±0.001mg/l·h。相比较nb，因为nb的毒性高于v(v)，且不易被微生物降解，微生物更倾向于还原v(v)。当碳源较少时，微生物优先还原v(v)，当碳源充足时，微生物更好的还原降解nb。在之前的报道中指出，当碳源的量不足以微生物降解v(v)和pcp时，微生物优先会降解v(v)，当碳源充足时pcp被微生物还原。

与此同时，我们探究了nb和v(v)还原过程中不同操作因素条件下的伪一级动力学模拟方程(图5中的a-f)，同时，不同影响因素下的伪一级动力学方程及相关参数表4-3所示。从伪一级动力学模拟的降解速率参数来看，随着nb和v(v)浓度分别增加时，e-nb-v反应器中速率逐渐下降，尤其是当nb浓度从5mg/l增加至20mg/l时，nb降解速率指数从0.0641h-1降低至0.0205h-1，nb降解速率下降幅度为0.0436h-1，而v(v)降解速率指数从0.0597h-1降低至0.0196h-1，v(v)降解速率下降幅度为0.0401h-1，而反观当v(v)浓度从5mg/l增加至20mg/l时，nb降解速率指数从0.0736h-1降低至0.0363h-1，nb降解速率下降幅度为0.0373h-1，而v(v)降解速率指数从0.0485h-1降低至0.0163h-1，v(v)降解速率下降幅度为0.0322h-1。从降解速率来看，nb的毒性高于v(v)，且v(v)优先nb被还原降解。

表4-3e-nb-v生物反应器影响因素研究的伪一阶动力学方程及相关参数

表4-3续表

实施例7，微生物群落的演化

表4-4批实验接种污泥与四组实验反应器阳极微生物群落的丰富度与多样性指数

表4-5批实验接种污泥与四组实验反应器阴极微生物群落的丰富度与多样性指数

通过微生物群落分析发现，微生物群落发生了明显的变化，微生物的丰富度随着nb和v(v)的增加而降低，如稀疏性曲线所反映的一样(图6中的a和图6中的b)。从ace和chao指数变化来看，与接种物相比，由于受到nb和v(v)双重毒性的胁迫，微生物群落的丰富度下降。从shannon和simpson指数来看，与接种物来看，实验组e-nb-v、e-v、e-nb和b-nb-v的微生物多样性下降。这表明，在一定的电压的刺激下，nb和v(v)双重复合污染下，选择出微生物群落中的特定物种。

我们对主要反应器阴阳极微生物群落的β多样性进行了研究。基于微生物属水平的主成分分析分析(pca)表明，e-nb-v反应器阴阳极的微生物群落与其他样品以及接种物的距离明显较远(图7中的a和图7中的c)，表明在nb和v(v)的共存体系下，双重毒性对微生物群落的结构有很大影响。nb或v(v)的单一毒性也通过e-nb和e-v到接种物的距离来反映。然而，从阳极(图7a中的)来看，e-nb-v和接种物之间的距离比其他组更远，而在阴极来看(图7中的c)，e-nb-v与接种物之间的距离比其他组更近，这表明nb主要在阴极处，微生物更好的将nb还原降解，而阳极受到nb毒性的胁迫，对微生物群落结构有很大影响。

venn图显示了四个生物反应器中微生物群落阴阳极的差异和相同之处(图7中的b和图7中的d)。阳极和阴极分别共有164和305个otus，这说明了在生物反应器的阳极和阴极中具有去除nb和v(v)能力的细菌稳定存在。

图7中的e和图7中的g显示了主要反应器阳极和阴极的门水平的细菌相对丰度。从两极微生物群落来看，proteobacteria和firmicutes在e-nb-v中占主导地位，分别占总种系的37.7％和41.6％，显著高于接种体(21.1％和4.12％)，这可能是由于这两个物种适应毒性物质的胁迫，即nb或v(v)。在阳极微生物群落中，e-nb和e-v中的proteobacteria和bacteroidota明显富富集，相对丰度分别为50.5％和31.2％，12.0％和7.09％，同时在阴极微生物群落中也发现相同的情况，表明这两个门的某些属可能参与了nb和v(v)还原降解。在b-nb-v中，相比较接种物来讲，chloroflexi和halobacterota显著富集，分别占总种系的23.7％和24.2％，不同于其他反应体系，可能的原因是在电刺激的作用下，可能会富集参与nb和v(v)还原的菌属。

在属水平上鉴定了微生物阳极和阴极可能的功能物种(图7中的f和图7中的h)。当在反应体系中同时加入nb和v(v)时，在阳极微生物群落中，如图7中的d，sphingobium、clostridium_sensu_stricto_12、longilinea、pseudoxanthomonas、acetobacterium在e-nb-v体系中富集，其中clostridium_sensu_stricto_12和acetobacterium在e-nb-v丰度最高，分别为2.66和3.29％，而其在接种物中的比例仅为0.012％和0。其中clostridium_sensu_stricto_12作为clostridium物种之一，其本身是一种电活性细菌，在阳极富集，具有传输电子进而促进有机物降解的能力。在mfc中clostridium_sensu_stricto_12具有较高的丰度，而且clostridium_sensu_stricto_12是耐v细菌的一种，故而该细菌表现出对v(v)有较好的还原能力和一定的耐v性。因此在生物阳极上，clostridium_sensu_stricto_12不但可以作为电活性细菌传递电子，同时在一定的程度上具有还原体系中的v(v)的作用。此外，在阳极上，接种物中pseudoxanthomonas的相对丰度较低(0.047％)，但在e-nb-v(1.41％)和e-v中变得丰富。有报道指出pseudoxanthomonas在电微生物系统(ems)电流作用下富集，并具有降解木质素的能力，推测pseudoxanthomonas作为电活性细菌，在阳极上富集，一方面利用有机碳源乙醇，促进细胞外电子传递，促进nb降解，另一方面，有相关报道指出，pseudoxanthomonas具有降解有机合成化合物的能力，推测在阳极nb还原产物an在阳极处pseudoxanthomonas的作用下部分降解矿化，这可能是e-nb-v体系中toc降低和部分an生成量减少的原因。与此同时，pseudoxanthomonas在e-v体系阳极富集，推测该细菌利用乙醇作为电子供体，促进细胞外电子的传递，还原溶液中v(v)。从阴极微生物群落来看，clostridium_sensu_stricto_12、acetobacterium和longilinea在e-nb-v和e-nb体系中富集，有相关报道指出acetobacterium具有还原三氯甲烷脱氯的作用，由此推测该细菌在阴极富集，可能对nb的还原降解有一定的促进作用。acetobacterium能倾向于利用有机物提供电子来进行v(v)的生物还原，因此同时还原nb和v(v)可以部分归因于acetobacterium的富集。与nb降解相关的菌属methanosarcina在e-nb(4.89和4.90％)和b-nb-v(15.8和15.9％)中富集，他们作为重要的降解细菌，可以降解nacs、四氯乙烯(pce)和三氯乙烯(tce)。methanosarcina是一种耐v细菌，且能进行v(v)的还原，longilinea是一种厌氧降解v(v)的细菌，该细菌在e-nb-v(5.71％)和e-v(19.8％)体系中富集，可促进体系中v(v)的降解，降低v(v)的生物毒性。与此同时，sphingobium和terrimonas在e-nb-v(0.97％和0.17％)中略高于接种体(0.012％和0.11％)，有研究表明sphingobium能够氧化有机物质转化成小分子有机物质，推测sphingobium能够利用乙醇有机物质为nb的还原提供电子，促进nb和v(v)的还原。与此同时相关研究指出terrimonas能降解多溴联苯醚(pbdes)，推测该细菌对nb的还原和产物an的矿化有一定的促进作用。

总而言之，在模拟含水层中通入一定的电流刺激(0.6v)可以促进nb和v(v)生物还原过程。在阳极群落中clostridium_sensu_stricto_12和pseudoxanthomonas两个电活性细菌富集，可以加强电子传递，促进nb和v(v)还原，阴极群落中methanosarcina可以实现nb和v(v)的生物还原。sphingobium能以乙醇为共代谢底物还原nb和v(v)。nb部分矿化并产生an，而v(v)主要通过微生物还原转化为不溶性v(iv)。

这项研究验证了在生物电化学体系下，促进微生物进行nb和v(v)还原作用，这是首次将电刺激微生物方法应用于nb与v(v)复合污染的地下水环境中，而且相比较原位生物修复更加有效。同时在研究当中发现能同时进行nb与v(v)还原的功能微生物物种(methanosarcina和sphingobium)。在生产生活中，可以通过加入促进电子穿梭的物质，比如生物炭、褐煤、纳米零价铁、单质硫，天然矿物等来促进nb与v(v)还原的进程。

综合以上，本说明实施例研究长周期条件下优选四个不同电压电刺激下，促进微生物nb和v(v)的生物还原的可行性，分析在最佳电压下生物还原nb和v(v)的可行性，降解产物分析，影响因素条件分析，动力学变化，以及微生物群落变化的研究，得出如下结论：

(1)优选最佳电压实验表明，在0.6v电压的刺激，乙醇为外加碳源，48h内nb去除率达到94.3±1.32％，v(v)的去除率达到87.2±0.856％，nb的伪一级动力学速率常数为0.0534h-1，v(v)的伪一级动力学速率常数为0.0438h-1，均高于其他电压的反应器。因此0.6v电压是最佳电压。

(2)在确定最佳电压为0.6v之后，运行四个中心实验组生物反应器电-硝基苯-钒、电-硝基苯、电-钒、硝基苯-钒即e-nb-v、e-nb、e-v和b-nb-v直至稳定，在典型的48h操作中，在e-nb中nb去除率达到96.2±2.10％，平均去除率为0.200±0.004mg/l·h。nb拟一级动力学速率常数为0.0649h-1。在最优电压0.6v的电刺激下，微生物能很好还原nb。

(3)测定实验结束之后的反应产物，nb很好还原为an，xps、eds和总钒分析v(v)被还原成v(iv)。

(4)影响因素研究发现，初始nb与v(v)浓度的升高，都会影响到nb与v(v)的还原速率，在nb和v(v)的影响因素研究中，发现v(v)都会优先于nb被还原，这说明nb的毒性高于v(v)。nb和v(v)的生物降解速率随着乙醇用量的增加而增加。当碳源较少时，微生物优先还原v(v)，当碳源充足时，在电刺激下，nb和v(v)的还原速率加快。

(5)16srrna技术揭示了微生物群落变化，在阳极群落中clostridium_sensu_stricto_12和pseudoxanthomonas两个电活性细菌富集，可以加强电子传递，促进nb和v(v)还原，阴极群落中methanosarcina和sphingobium可以实现nb和v(v)的生物还原。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。